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技術與支持
實驗技術指南
免疫組化操作流程

(一) 儀器設備
1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
2. 水浴鍋

 (二) 試 劑
1. PBS緩沖液(ph7.2―7.4):NaC137mmol/L,KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L.
2.0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,ph6.0,1000ml):檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。
3.0.5mol/L EDTA緩沖液(ph8.0):700ml水中溶解186.1g EDTA&
8226;2H2O,用10mmol/L
NaOH調至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS緩沖液(ph8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調至ph8.0,加水1000ml。
5. 酶消化液:a. 0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 風裱劑:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(ph9.0–9.5)等量混合
b 油和TBS(PBS)配制
8.TBS/PBS PH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標本;ph7.0-7.4適合光學纖維標本
 

(三) 操作流程
1 脫蠟和水化:脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。 a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 無水乙醇中浸泡五分鐘
c 95%乙醇中浸泡五分鐘
d 75%乙醇中浸泡五分鐘
2 抗原修復:用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片:
A 抗原熱修復
a 高壓熱修復 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋,但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上,緩慢加壓,是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源,置入涼水中,當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。
b 沸熱修復 電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10-15分鐘。
C 微波爐加熱 在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5-10分鐘,反復1-2次。適用的抗原:
Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.
ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃,消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP.
Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
 
3 免疫組化染色
 
SP法
(1) 脫蠟、水化
(2)PBS洗2-3次各5分鐘
(3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘
(4)PBS洗2-3次各5分鐘
(5)抗原修復
(6)PBS洗2-3次各5分鐘
(7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體
(8)滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時
(9)4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘
(10)PBS洗3次每次2分鐘
(11)滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時
(12)Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.
(13)PBS洗3次各5分鐘
(14)DAB顯色5-10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度
(15)PBS或自來水沖洗10分鐘
(16)蘇木精復染2分鐘,鹽酸酒精分化
(17)自來水沖洗10-15分鐘
(18)脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
(1) 脫蠟、水化
(2)PBS洗2次各5分鐘
(3)用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2,室溫封閉5-10分鐘,用蒸餾水洗3次
(4)抗原修復
(5) PBS洗5分鐘
(6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體
(7)滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時
(8)PBS洗3次各2分鐘
(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分鐘
(10)PBS洗3次各2分鐘
(11)滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
(12) PBS洗4次各5分鐘
(13) DAB顯色:試劑盒或自配顯色劑顯色
(14)脫水、透明、封片、鏡檢。

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